本发明提供了一种防治棉花黄萎病菌剂,该菌剂包括培养基和菌体,其中,所述菌体包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、灰绿链霉菌(Streptomyces viridogriseus)和荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)。本发明提供的菌剂能够有效地防治棉花黄萎病,降低棉花黄萎病大爆发的风险,提高棉农收入,具有广阔的应用前景。本发明还提供了所述菌剂的制备方法及该菌剂在预防棉花黄萎病中的应用。