本实用新型公开了一种乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA,包括盒体(1)、位于盒体(1)内的衬垫(2),所述衬垫(2)包括第一层衬垫,所述第一层衬垫上设有至少有8个容器孔(3),所述容器孔(3)分别设置有:PSAD反应试剂1管、特异性扩增HBV cccDNA引物5管、BstDNA聚合酶1管、LAMP反应缓冲液1管。本试剂盒试剂盒使用环介导等温扩增,无需PCR仪器或专门的仪器设备,所采用的引物及试剂用于扩增HBV cccDNA特异性高、敏感性强,扩增后易于判断,且操作简便灵活,易于掌握;该试剂盒设计合理、操作方便,易于推广。
1.一种乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测试剂盒,包括盒体(1)、位于盒体(1)内的衬垫(2),其特征在于,所述衬垫(2)包括第一层衬垫,所述第一层衬垫上至少设有8个容器孔(3),所述容器孔(3)中分别放置有:PSAD反应试剂1管、特异性扩增HBVxa0cccDNA引物5管、BstDNA聚合酶1管、LAMP反应缓冲液1管。
2.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测试剂盒,其特征在于,所述衬垫(2)还包括第二层衬垫,所述第二层衬垫设置有至少24个样本孔(4),所述样本孔(4)对应设置有样本反应管(6)。
3.根据权利要求1或2所述的一种乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测试剂盒,其特征在于,所述容器孔(3)中还设置有去离子水1管。
4.根据权利要求1或2所述的一乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测试剂盒,其特征在于,所述衬垫(2)还包括第三层衬垫,所述第一层衬垫上的容器孔(3)为沿其厚度方向的非贯穿孔,所述第二层衬垫上的样本孔(4)为沿其厚度方向的贯穿孔,所述第二层衬垫设置在第一层衬垫的下方,所述第三层衬垫设置在第二层衬垫下方、且具有与第二层衬垫上样本孔(4)的位置及数量相匹配的凹槽(5)。
5.根据权利要求4所述的一种乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测试剂盒,其特征在于,所述样本孔(4)的孔距和所述凹槽(5)的的槽距均与金属浴上的孔距一致。
6.根据权利要求1或2所述的一种乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测试剂盒,其特征在于,所述特异性扩增HBVxa0cccDNA引物包括一对内引物FIP和BIP、一对外引物B3和F3、一条环状引物LoopB。技术领域
本实用新型涉及HBVxa0DNA技术领域,具体是一种乙型肝炎病毒检测试剂盒。
背景技术
HBVxa0cccDNA是乙型肝炎共价闭合环状DNA,检测HBVxa0cccDNA用途主要用来作为评价抗HBV疗效的或临床治疗终点,以及评价HBV感染状态及传染性参考依据。目前临床应用最多的检测乙肝病毒的指标是血清中HBVxa0DNA的检测,但是许多临床和实验研究表明,一些乙肝病人应用抗病毒药物治疗后血液检查HBVxa0DNA虽然已经呈阴性,但是肝组织炎症活动度并未缓解,还有部分患者出现耐药而导致反跳现象,这是因为患者病毒复制的“老巢(HBVxa0cccDNA池)”并未被清除,因此检测HBVxa0cccDNA是评价抗HBV疗效的或临床治疗终点的一项重要标准,也是评价HBV感染状态及传染性的客观指标。目前还没有国家批准的稳定可靠的的敏感的HBVxa0cccDNA检测试剂盒用于临床,用于研究用的HBVcccDNA定量检测试剂盒有荧光定量PCR试剂盒、滚环扩增联合荧光定量试剂盒,用于定性检测的试剂盒有DNA印记杂交(southern)试剂盒。现有技术中检测HBVxa0cccDNA的试剂盒操作起来较为繁琐,使用起来很不方便,而且这些试剂盒内的试剂储存的时间较短,长时间储存后试剂盒内的荧光会减弱,从而会导致检测结果的不准确。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本实用新型提供一种乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测试剂盒,使检测HBVxa0cccDNA的过程更为便捷,并可直观的判断出检测的结果,不需要设备辅助,同时该试剂盒内的试剂不会因长时间的储存而使检测结果不准确。为了实现上述目的,本实用新型提供一种乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测试剂盒,包括盒体、位于盒体内的衬垫,所述衬垫包括第一层衬垫,所述第一层衬垫上至少设有8个容器孔,所述容器孔中分别放置有:PSAD反应试剂1管、特异性扩增HBVxa0cccDNA引物5管、BstDNA聚合酶1管、LAMP反应缓冲液1管。在该技术方案中,通过上述PSAD反应(质粒安全的ATP依赖性DNA酶)试剂的设置,可以快速地除去样本DNA中部分非HBVxa0cccDNA的影响,从而相对地保证样本DNA中模板DNA的纯度,能够提高检测的特异性。进一步,所述衬垫还包括第二层衬垫,所述第二层衬垫设置有至少24个样本孔,所述样本孔对应设置有样本反应管。在该技术方案中,通过第二层衬垫的设置,可以使HBVxa0cccDNA检测过程更加便捷。进一步,所述容器孔中还设置有去离子水1管。在该技术方案中,通过设有去离子水,可以方便去相应试剂进行稀释,从而方便了检测操作过程。进一步,所述衬垫还包括第三层衬垫,所述第一层衬垫上的容器孔为沿其厚度方向的非贯穿孔,所述第二层衬垫上的样本孔为沿其厚度方向的贯穿孔,所述第二层衬垫设置在第一层衬垫的下方,所述第三层衬垫设置在第二层衬垫下方、且具有与第二层衬垫上样本孔的位置及数量相匹配的凹槽。在该技术方案中,通过第三层衬垫的设置,可以方便将第二层衬垫上的样本反应管底部放入凹槽内,从而能使便于对样本反应管进行固定,使样本反应管不会倾斜,尤甚是在试剂盒移动时能对样本反应管起到很好的保护作用;另外该第三层衬垫可以作为样本反应管的架子使用,这样在操作时不需要另外寻找放置样本反应管的架子,也不需要逐一地将样本反应管取出,可以直接将第二层衬垫、第三层衬垫连同上面的样本反应管一起取出,即方便了操作、又能有效防止样本发生污染;还可使第一层衬垫上的试剂管和第二层上的样本反应管处于两个独立的空间内,使其不相接触;使第一层衬垫放在最上层,这样可以使冷冻储存的试剂盒在使用时,其中的试剂可以在室温下进行快速的溶解。进一步,所述样本孔的孔距和所述凹槽的的槽距均与金属浴孔距一致。在该技术方案中,通过使样本孔的孔距和凹槽的的槽距均与金属浴上的孔距一致,这样当样本反应管中加完样本和试剂后,可以直接将放有样本反应管的第二块衬垫放入金属浴或水浴锅中进行反应,从而方便了操作过程。进一步,所述特异性扩增HBVxa0cccDNA引物包括一对内引物FIP和BIP、一对外引物B3和F3、一条环状引物LoopB。在该技术方案中,通过使用上述5种特异性扩增HBVxa0cccDNA引物进行检测,可以使HBVcccDNA检测结果直观的显现出来,使检测人员通过目测就可以判断出HBVxa0cccDNA检测结果,而且上述5种特异性扩增HBVxa0cccDNA引物容易保存,在长期保存后也不会降低检测结果的准确性。本试剂盒将试剂管、样本反应管、样本反应管管架(由第二层衬垫与第三层衬垫组成)放置同一试剂盒内,使检测的操作很简便,同时又能防止样本发生污染而引起的检测特异性下降,在操作结束可以直接将样本反应管连同第二层衬垫一起销毁,进而避免了环境的污染,第三块衬垫所示设有凹槽既可以固定样本反应管,又可以与第二层衬垫一起构成样本反应管架,还可以拆卸,第二层衬垫的作用不但可以用作样本架,还可以直接将第二层衬垫与样本反应管一起放入金属浴或水浴锅中进行扩增反应,不用将反应管逐一取出放入金属浴或水浴锅中,省却了操作步骤,节约了操作时间,而且检测的样本的数量可根据需要灵活地进行选择。本试剂盒使用环介导等温扩增,无需PCR仪器或专门的仪器设备,所采用的引物及试剂用于扩增HBVxa0cccDNA特异性高、敏感性强,扩增后易于判断,且操作简便灵活,易于掌握;该试剂盒设计合理、操作方便,易于推广。
附图说明
图1为本实用新型的结构示意图。图中:1、盒体,2、衬垫,3、容器孔,4、样本孔,5、凹槽,6、样本反应管。
具体实施方式
下面结合附图对本实用新型作进一步说明。文中提到的PSAD反应试剂、特异性扩增HBVxa0cccDNA引物、BstDNA聚合酶、LAMP反应缓冲液在储存时均单独地装在试剂管中。如图1所示,一种乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBVxa0cccDNALAMP)检测试剂盒,包括盒体1、位于盒体1内的衬垫2,所述衬垫2包括第一层衬垫,所述第一层衬垫上至少设有8个容器孔3,所述容器孔3中分别放置有:PSAD反应试剂1管、特异性扩增HBVxa0cccDNA引物5管、BstDNA聚合酶1管、LAMP反应缓冲液1管。在该实施方式中,通过上述PSAD反应(质粒安全的ATP依赖性DNA酶)试剂的设置,可以快速地除去样本DNA中部分非HBVxa0cccDNA的影响,从而相对地保证样本DNA中模板DNA的纯度,能够提高检测的特异性。所述衬垫2还包括第二层衬垫,所述第二层衬垫设置有至少24个样本孔4,所述样本孔4对应设置有样本反应管6。在该实施方式中,通过第二层衬垫的设置,可以使HBVxa0cccDNA检测过程更加便捷。所述容器孔3中还设置有去离子水1管。在该实施方式中,通过设有去离子水,可以方便去相应试剂进行稀释,从而方便了检测操作过程。所述衬垫2还包括第三层衬垫,所述第一层衬垫上的容器孔3为沿其厚度方向的非贯穿孔,所述第二层衬垫上的样本孔4为沿其厚度方向的贯穿孔,所述第二层衬垫设置在第一层衬垫的下方,所述第三层衬垫设置在第二层衬垫下方、且具有与第二层衬垫上样本孔4的位置及数量相匹配的凹槽5。在该实施方式中,通过第三层衬垫的设置,可以方便将第二层衬垫上的样本反应管6底部放入凹槽5内,从而能便于对样本反应管6进行固定,使样本反应管6不会倾斜,尤甚是在试剂盒移动时能对样本反应管6起到很好的保护作用;另外该第三层衬垫可以作为样本反应管6的架子使用,这样在操作时不需要另外寻找放置样本反应管6的架子,也不需要逐一地将样本反应管6取出,可以直接将第二层衬垫、第三层衬垫连同上面的样本反应管6一起取出,即方便了操作、又能有效防止样本发生污染;还可使第一层衬垫上的试剂管和第二层上的样本反应管6处于两个独立的空间内,使其不相接触;使第一层衬垫放在最上层,这样可以使冷藏储存的试剂盒在使用时,其中的试剂可以在室温下进行快速的溶解。所述样本孔4的孔距和所述凹槽5的的槽距均与金属浴孔距一致。在该实施方式中,通过使样本孔的孔距和凹槽5的的槽距均与金属浴孔距一致,这样当样本反应管6中加完样本和试剂后,可以直接将放有样本反应管6的第二块衬垫放入金属浴或水浴锅中进行反应,从而方便了操作过程。所述特异性扩增HBVxa0cccDNA引物包括一对内引物FIP和BIP、一对外引物B3和F3、一条环状引物LoopB。在该实施方式中,通过使用上述5种特异性扩增HBVxa0cccDNA引物进行检测,可以使HBVcccDNA检测结果直观的显现出来,使检测人员通过目测就可以判断出HBVxa0cccDNA检测结果,而且上述5种特异性扩增HBVxa0cccDNA引物容易保存,在长期保存后也不会降低检测结果的准确性。试剂盒使用时,将第一层衬垫上的PSAD反应(质粒安全的ATP依赖性DNA酶)试剂取出,该PSAD反应试剂是一种混合液(含有10×buffer、ATP、PSAD酶),将PSAD反应试剂在室温下溶解后混匀,取3.2ulPSAD反应试剂和6.8ul样本DNA计10ul体积,分别加入第二层衬垫中选定的样本反应管6中,吹打混匀后,将第二层衬垫连同选定的样本反应管6一起放在金属浴或恒温水浴锅进行反应,设定温度为37°C的条件下反应30分钟后,再将温度设定为70°C再使其反应10分钟,这样就完成了PSAD酶的消化反应,从而就能去除了非HBVxa0cccDNA的影响,从而相对地保证样本DNA中模板DNA的纯度,提高检测的特异性。然后直接向选定的样本反应管6中加入20ulLAMP反应缓冲液(环介导等温扩增反应混合液),该LAMP反应缓冲液是一种混合液、其包括2×buffer10ul(含dNTP、Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine混合液),然后再加入稀释后的5条引物(一对内引物FIP和BIP、一对外引物B3和F3、一条环状引物LoopB)各1ul、BstDNA聚合酶1ul、去离子水4ul,使总计体积为30ul,吹打混匀后弹去气泡直接将第二层衬垫连同样本反应管6放入金属浴或恒温水浴锅(最好是金属浴,其加热速度快,操作相对方便,且在扩增结束反应过程中样本反应管6外壁无水渍,便于观察)63°C恒温反应30-60分钟,再在80°C条件下反应5分钟,阳性者反应管会呈现混浊不透明状态,阴性则为透明状态,从而能通过目测判断出检测结果。本试剂盒将试剂管、样本反应管6、样本反应管6管架(由第二层衬垫与第三层衬垫组成)放置同一试剂盒内,使检测的操作很简便,同时又能防止样本发生污染而引起的检测特异性下降,在操作结束可以直接将样本反应管6连同第二层衬垫一起销毁,进而避免了环境的污染,第三块衬垫所示设有凹槽5既可以固定样本反应管6,又可以与第二层衬垫一起构成样本反应管6架,还可以拆卸,第二层衬垫的作用不但可以用作样本架,还可以直接将第二层衬垫与样本反应管6一起放入金属浴或水浴锅中进行扩增反应,不用将反应管逐一取出放入金属浴或水浴锅中,省却了操作步骤,节约了操作时间,而且检测的样本的数量可根据需要灵活地进行选择。本试剂盒中的引物是针对HBVxa0cccDNA与HBVxa0DNA结构的差别,使用环介导等温扩增引物设计软件设计的特异性扩增HBVxa0cccDNA引物,针对HBVxa0cccDNA基因6个区段设计引物共5条,分5管分装,分别是一对内引物FIP和BIP,一对外引物B3和F3,以及一条环状引物LoopB。本试剂盒进行环介导等温扩增HBVxa0cccDNA,使用的是环介导扩增专用的BstDNA聚合酶和LAMP(环介导扩增)反应缓冲液环介导扩增反应缓冲液,本试剂盒配备BstDNA聚合酶1管、LAMP(环介导扩增)反应缓冲液1管,使用本试剂盒中的引物进行环介导等温扩增能相对特异性地扩增HBVxa0cccDNA片段,无需PCR仪器或专门的仪器设备,所采用的引物及试剂用于扩增HBVxa0cccDNA特异性高、敏感性强,扩增后易于判断,且操作简便灵活,易于掌握;在DNA扩增的同时会出现衍生物焦磷酸镁呈白色混浊物,根据有无焦磷酸镁的产生,即可判断出有无HBVxa0cccDNA的扩增,是否为阳性,该试剂盒设计合理、操作方便,尤其方便那些缺少PCR仪器的基层医院使用,易于推广。