本发明公开了一种利用gma‑miR156b及其前体基因培育高产植物的方法,首先构建含有SEQ ID NO：2所示microRNA前体序列的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选得到与正常植物相比具有多分枝、多荚、多籽粒的高产转基因植物。通过在大豆植株中过表达上述microRNA，可以显著增加大豆的分枝数，由平均的2个分枝增加到8个分枝，转基因大豆的单株荚数也增加了59％，单株荚粒数也增加了2‑3倍。
1.序列表中SEQ ID NO：1所示microRNA的在培育多分枝和多荚和多籽粒株型植物中的应用，其特征在于：首先构建含有SEQ ID NO：2所示microRNA前体序列的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选得到与正常植物相比具有多分枝、多荚、多籽粒的高产转基因植物；所述目的植物为大豆。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：构建含有SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列的重组表达载体的步骤为：1）、首先以大豆Wilimas82植物叶片DNA为模板，扩增获得SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列并连接至T载体上，然后用限制性内切酶Age I和BamH I酶切所得T载体质粒，回收酶切产物；2）、然后用限制性内切酶Age I和BamH I酶切空载体pEGAD，回收载体骨架；3）、最后用T4连接酶将步骤1）的酶切产物和步骤2）的载体骨架连接；4）、将步骤3）的连接产物热激转化大肠杆菌感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序验证，得重组表达载体pEGAD-35S::gma-miR156b。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：采用液氮冻溶法转化农杆菌EHA105得转化体，具体操作步骤包括：a.取出冻存的200 μl 感受态农杆菌细胞，融化后加入5-10 μl 重组表达载体的质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min；b.放入液氮中5 min后取出，将管转入37℃、5 min 融化后，加入800μl YEP液体培养基，28℃ 低速振荡、150 rpm，4-5 h；d.10000 rpm，30 sec, 去上清，加100 μl YEP 液体培养基，悬浮菌体后涂板；e.置于28℃ 培养至白色转化子长出，挑取阳性单克隆摇菌，用于植株子叶节转化。技术领域
本发明涉及一种植物中与株型和产量相关的microRNA，特别涉及来源于大豆的与株型发育相关的gma-miR156b及其在培育高产大豆新品种方面的应用。
背景技术
大豆是非常重要的、具有特殊经济价值的作物。株型是大豆植株整体特征的集中表现，在大豆高产育种中发挥着非常重要的作用。大豆株型包括株高、节数、茎粗的动态变化、分枝/分蘖数、分枝长度和角度等植株形态特征。在生产中大豆的抗倒伏能力是其广适性栽培及其在不同环境条件下高产稳产的重要条件(Mancuso and Caviness,1991)。具有理想株型的大豆品种具有更好的抗倒伏能力。miRNA是近年来在生物体中发现的一类长度约为20-24nt非编码的小分子RNA，通过序列互补与特定靶基因的mRNA结合，因引起mRNA降解或抑制mRNA翻译而调控一些重要生理过程，被认为是植物重要性状分子调控的关键或主控调节元件(Master regulators)，已经成为世界生物科学研究的热点和前沿。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用gma-miR156b及其前体基因培育多分枝、多荚、多籽粒高产植物的方法。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。序列表中SEQ ID NO：1所示gma-miR156b的在培育多分枝和/或多荚和/或多籽粒株型植物中的应用。作为本发明的一种优选技术方案，在植物中过表达SEQ ID NO：1所示的gma-miR156b，培育出具有多分枝和/或多荚和/或多籽粒株型的转基因植物。作为本发明的一种优选技术方案，首先构建含有gma-miR156b前体序列的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选得到与正常植物相比具有多分枝、多荚、多籽粒的高产转基因植物；所述gma-miR156b前体序列如SEQ ID NO：2所示。作为本发明的一种优选技术方案，构建含有SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列的重组表达载体的步骤为：1)、首先以植物叶片DNA为模板，扩增获得SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列并连接至T载体上，然后用限制性内切酶Age I和BamH I酶切所得T载体质粒，回收酶切产物；2)、然后用限制性内切酶Age I和BamH I酶切空载体pEGAD，回收载体骨架；3)、最后用T4连接酶将步骤1)的酶切产物和步骤2)的载体骨架连接；4)、将步骤3)的连接产物热激转化大肠杆菌感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序验证，得重组表达载体pEGAD-35S::gma-miR156b。作为本发明的一种优选技术方案，采用液氮冻溶法转化农杆菌EHA105得转化体，具体操作步骤包括：a.取出冻存的200μl感受态农杆菌细胞，融化后加入5-10μl重组表达载体的质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；b.放入液氮中5min后取出，将管转入37℃、5min融化后，加入800μl YEP液体培养基，28℃低速振荡、150rpm，4-5h；d.10000rpm，30sec,去上清，加100μl YEP液体培养基，悬浮菌体后涂板；e.置于28℃培养至白色转化子长出，挑取阳性单克隆摇菌，用于植株子叶节转化。作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为大豆。本发明还包括gma-miR156b的前体序列，其具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，在植物细胞内被剪切并表达得到对应的microRNA。本发明还包括含有gma-miR156b前体序列的重组表达载体。本发明还包括含有gma-miR156b前体序列的转化体。本发明还包括扩增gma-miR156b前体序列的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。采用上述技术方案所产生的有益效果在于：申请人的系列实验证明，通过在大豆植株中过表达gma-miR156b，可以显著增加大豆的分枝数，由平均的2个分枝增加到8个分枝；此外，转基因植株的单株荚数也增加了59％，更重要的是，单株荚粒数也增加了2-3倍；最终大幅度的提高了大豆的产量。
附图说明
图1为实施例1的试验结果，显示gma-miR156b在大豆不同组织中的表达模式，可见其在大豆叶片中的表达水平较高。图2为gma-miR156b过表达转基因植株的分子鉴定(实施例2步骤5)，对PCR鉴定纯合的株系(图2A)进行了草丁膦涂抹(图2B)及Bar试纸条(图2C)的分析；从图中可见，PCR阳性的转基因植株也呈现了对草丁膦的抗性，说明Bar基因正常表达，其蛋白具有膦化麦黄酮乙酰转移酶的活性。图3为gma-miR156b在转基因大豆植株当中的分子鉴定及过表达植株的农艺性状分析(实施例2步骤6)；结果显示，在纯合转基因株系中目的基因gma-miR156b的表达水平和野生型中的表达相比有明显提高(图3A)；过表达gma-miR156b的转基因植株同对照野生型W82相比，株高没有显著变化(图3C)，但株型发生显著变化(图3B)；过表达gma-miR156b可以显著增加大豆的分枝数，由平均的2个分枝增加到8个分枝(图3D)；此外，过表达gma-miR156b转基因植株的单株荚数也增加了59％(图3E)；更重要的是，单株荚粒数也增加了2-3倍(图3F)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1gma-miR156b在大豆中的的表达模式分析通过实时荧光定量PCR技术分析gma-miR156b在大豆叶、茎、根及根瘤中的表达特性，同时检测gma-miR156b在转基因植株中的表达特性。(1)材料获取：实验所用材料为Wilimas82(威廉姆斯82，下文简称W82)，材料按照以下流程进行处理：大豆种子用70％的酒精灭菌30S，播种于低氮营养液浸泡的蛭石珍珠岩(3:1)混合基质中，于培养室中培养，16h光/8h暗，光强7000LUX,温度26℃，相对湿度为70％。播种后7天，每株接种慢生型根瘤菌USDA110菌液(OD₆₀₀:0.08)30ml，在接菌后28天时取大豆叶、茎、根及根瘤；(2)大豆不同组织中RNA的分离：取上步所得的大豆不同组织，提取RNA，具体提取方法如下：①用液氮在研钵中将材料充分研磨，将50mg-100mg研磨好的粉末放入1.5ml离心管中，加入1mL Redzol试剂(Vigorous公司)，冰上放置10min；②加入200μl氯仿，200μl RNA-free NaAC，振荡均匀后室温静置2-3min；③4℃，12,000g离心10min；④将上清移入另外一个离心管中，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，-20℃沉淀30min；⑤4℃，12,000g离心10min；⑥弃上清，用75％的乙醇(DEPC处理过的无菌水配制)洗1-2次；⑦小心去上清(尽力吸干)，室温静置使RNA干燥；⑧加适量DEPC处理水溶解RNA；⑨电泳检测RNA完整性。(3)反转录PCR：使用TIANGEN公司出品的FastQuant RT Kit(With gDNase)试剂盒(目录号：KR106)对上步所得大豆组织的RNA进行反转录克隆：①首先将总RNA末端进行gDNA去除处理，在10μl体系中加入总RNA 5μl5×gDNA Buffer 2μl，RNase-Free ddH₂O 3μl，彻底混匀上述配制的反应液，短暂离心后，42℃反应3min，放置于冰上；②然后配置反转录反应体系：10×Fast RT Buffer 2μl，RT Enzyme Mix 1μl，miR156b RT Primer(SEQ ID NO：5)1μl，miR1515a RT Primer 1μl，RNase-Free ddH₂O 5μl；③将反转录反应中的mix加到gDNA去除步骤(步骤①)的反应液中，充分混匀；42℃，孵育15min；95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可以直接进行下游荧光定量检测，或-20℃低温保存。(4)实时荧光定量PCR分析：使用TaKaRa公司出品的SYBR Premix Ex Tag^TM进行定量PCR分析；①在20μl体系中加入上步所得cDNA模板2μl、正反向引物各0.4μl、SYBR Primix Ex taq^TM(2×)10μl、ROX Reference Dye II(50×)0.4μl、ddH₂O6.8μl；②扩增程序为：95℃30s；95℃5s，60℃34s，45cycles；95℃15s，60℃1min，95℃15s；其中，正向引物为：GGACCTGACAGAAGAGAGAG(SEQ ID NO：6)；反向引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO：7)；(5)结果：gma-miR156b在大豆不同组织中的表达模式如图1所示，结果显示gma-miR156b在大豆叶片中的表达水平较高。实施例2、理想高产株型大豆的培育1、Wilimas82大豆DNA的提取a.大豆组织于研钵中用液氮研磨，将充分研磨的粉末移至1.5mL离心管中；加入500μL CTAB提取液(100mM，Tris-HCl(pH 8.0)，4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA(pH 8.0)，2％CTAB，使用前加入2mL/100mLβ-巯基乙醇)，混匀；b.65℃水浴30min，中间轻微振荡几次；c.置于冰上5min；d.加等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻混匀；e.室温，静置10min，12000rpm冷冻离心15min，取上清；f.加2倍体积冰乙醇，混匀，-20℃静置30min；g.离心，排出上清液；h.70％乙醇1mL漂洗2次，晾干；I.无菌水100μl溶解，-20℃冰箱长期保存。2、构建重组表达载体(1)gma-miR156b基因的克隆gma-miR156b的前体序列共181bp(SEQ ID NO：2)，根据该序列设计引物对，根据载体pEGAD多克隆位点，引物末端分别引入Age I和BamH I酶切识别位点，以大豆品种W82的DNA为模板进行PCR，扩增gma-miR156b的前体序列；引物序列为：gma-miR156b-F：5'-TGCACCGGTGGGTTCTATTGGTGGTTG-3'(SEQ ID NO：3)gma-miR156b-R：5'-CGGGATCCCGTCTACTTTGGCTAGAAAG-3'(SEQ ID NO：4)扩增程序为：95℃5分钟；95℃30秒，57℃30秒，72℃40秒，26个循环；72℃30秒；PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化181bp大小的条带；回收的DNA片段与pMD19-T载体(Takara公司)连接，10μl体系中加入T vector 1μl，solutionⅠ5μl，回收片段4μl，混匀混合液，16℃连接过夜，热击法转入E.coli大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交invitrogen公司测序。(2)重组表达载体的构建1)、提取含有正确测序的gma-miR156b前体基因序列的T载体质粒，用限制性内切酶Age I和BamH I酶切，回收酶切产物；2)、用限制性内切酶Age I和BamH I酶切空载体pEGAD，回收载体骨架；3)、用T4连接酶将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接；4)、将步骤3的连接产物热激转化大肠杆菌感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pEGAD-35S::gma-miR156b。3.农杆菌EHA105的转化采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作如下：a.取出冻存的200μl感受态细胞，融化后加入5-10μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；b.放入液氮中5min后取出，将管转入37℃(5min)融化后，加入800μl YEP(无抗性)液体培养基，28℃低速振荡(150rpm)4-5h；d.10000rpm，30sec,去上清，加100μl YEP液体培养基，悬浮菌体后涂板(含50mg/ml卡那霉素)；e.置28℃培养至白色转化子长出，挑取阳性单克隆摇菌，用于大豆子叶节转化；4.农杆菌EHA105介导的大豆子叶节遗传转化①以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒10小时；②在B₅培养基(培养基配方：2％蔗糖，0.8％琼脂粉(sigma)，1×GAMBORG B-5BASAL(Phyto Technology Laboratories，货号：G398)，pH调至5.7左右；)上萌发5天，用手术刀先将大豆带2cm胚轴切下，放入培养皿中，然后沿着子叶下轴垂直将其切开，留取下胚轴2mm左右，除去仍然连接在子叶上的胚轴组织；在子叶和子叶下胚轴的连接处的轴向上作5-7个切口，在活化的农杆菌EHA105中侵染30min(OD₆₀₀：0.8左右)；③将外植体转至共培养培养基(培养基配方：2％蔗糖，0.8％琼脂粉(sigma)，1.67mg/L 6-BA,0.25mg/L GA3,0.1×GAMBORG B-5BASAL(Phyto Technology Laboratories，货号：G398，pH调至5.4左右；)上共培生长3天后，再转至诱导培养基上诱导丛生芽(培养基配方：2％蔗糖，0.8％琼脂粉(sigma)，1.67mg/L 6-BA,10mg/L glufosinate,1×GAMBORG B-5BASAL(Phyto Technology Laboratories，货号：G398)，pH调至5.7左右)；④在诱导丛生芽后2周，取已生成的分生组织，在生长点的基部作新的切口(水平方向的)，并将培养组织移入伸长培养基(培养基配方：2％蔗糖，0.8％琼脂粉(sigma)，0.1mg/L IAA,1mg/L Zeatin,0.5mg/L GA3,10mg/L glufosinate,1×MURA SHIGE&SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories，货号：M404)，pH调至5.7左右)；⑤每两周将培养物向新的培养基上转移一次；每次转移时在外植体的基部作一个新的水平切口；⑥在6-8周培养以后，将伸长的芽(一般剪取芽长＞4cm)在1mg/ml IBA中蘸根后移入生根培养基上生根(培养基配方：2％蔗糖，0.8％琼脂粉(sigma)，0.5×MURA SHIGE&SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories，货号：M404)，pH调至5.7左右))；培养大约2-4周，长出足量的根系时，进行移栽；⑦将生根的小苗小心移入小花盆中，花盆里放入(进口土：营养土＝1：1)培养土；移栽后需套保鲜袋一周，使苗习惯于土壤的新环境并保持湿度，培养间的温度于26℃，一周后取下保鲜袋；⑧待转基因苗恢复生长后用Bar基因检测、草丁膦glufosinate(SIGMA，45520)涂抹叶片以及Bar试纸条(ENVIROLOGIX,042043)三种方法进行转化鉴定，收获Bar基因阳性转基因株系，在T1、T2代的阳性植株及T3代的纯合转基因株系进行目的基因的表达分析以及表型的鉴定。5.转基因植株的分子鉴定对T1和T2代阳性的植株后代进行了较为系统的选择Bar基因表达及基因产物功能的鉴定。其中包括纯合株系PCR鉴定Bar基因、叶片涂抹草丁膦及Bar试纸条的分析。1)PCR检测反应法:提取大豆基因组DNA用于PCR检测。检测Bar基因是否转入大豆基因组中。Bar基因引物:F:CTACATCGAGACAAGCACGGTCAA(SEQ ID NO：8)，R:AGAAACCCACGTCATGCCAGTTC(SEQ ID NO：9)。大豆叶片DNA提取方法如下：a.大豆组织于研钵中用液氮研磨，将充分研磨的粉末移至1.5mL离心管中；加入650mL CTAB提取液(100mM，Tris-HCl(pH 8.0)，4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA(pH 8.0)，2％CTAB，使用前加入2mL/100mLβ-巯基乙醇)，混匀；b.65℃水浴30min，中间轻微振荡几次；c.置于冰上5min；d.加等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻混匀；e.室温，静置10min，12000rpm冷冻离心15min，取上清；f.加2倍体积冰乙醇，混匀，-20℃静置30min；g.离心，排出上清液；h.70％乙醇1mL漂洗2次，晾干；无菌水100μl溶解，-20℃冰箱长期保存。2)除草剂涂抹法:将Basta原液稀释为浓度130mg/L，在大豆第一对三出复叶完全展开时，以主叶脉为分界线，用记号笔标记半片叶子，然后用棉签蘸取草丁膦液体擦拭已标记的半片叶子，5天后观察叶片对除草剂的反应。如为阳性植株则除草剂涂抹过的叶片与未涂抹的叶片相比没有太大变化，如为阴性植株则涂抹过除草剂的叶片明显变黄甚至枯萎。3)Bar试纸条快速鉴定法:取少许叶片放入1.5mL离心管中，用研磨棒研碎叶片，加入300μL提取液，搅拌均匀，将试纸条按规定的方向插入混合液中，5min后观察结果。试纸条出现2条带就表明该植株是阳性植株，出现1条说明是阴性植株。6.结果观察1)Bar基因检测结果：对T1和T2代阳性的植株后代进行了较为系统的选择Bar基因表达及基因产物功能的鉴定。其中对PCR鉴定纯合的株系(图2A)进行了草丁膦涂抹(图2B)及Bar试纸条(图2C)的分析。从图中可见，PCR阳性的转基因植株也呈现了对草丁膦的抗性，说明Bar基因正常表达，其蛋白具有膦化麦黄酮乙酰转移酶的活性。2)gma-miR156b在转基因植株当中的分子鉴定及农艺性状分析：由于gma-miR156b是和Bar基因共转化的，因此，对上述Bar基因纯合株系随后进行了gma-miR156b的表达分析。如图3所示，在纯合转基因株系中目的基因gma-miR156b的表达水平和野生型中的表达相比有明显提高(图3A)。并对这些转基因植株的生长习性、株型特点等农艺性状进行了跟踪观察。发现过表达gma-miR156b的转基因植株同对照野生型W82相比，株高没有显著变化(图3C)但株型发生显著变化(图3B)。过表达gma-miR156b可以显著增加大豆的分枝数，由平均的2个分枝增加到8个分枝(图3D)；此外，过表达gma-miR156b转基因植株的单株荚数也增加了59％(图3E)；更重要的是，单株荚粒数也增加了2-3倍(图3F)，从而大幅度的提高了大豆的产量。因此，gma-miR156b是决定大豆理想株型和高产的重要的基因。上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件，例如：含有本发明miRNA的前体序列，成熟miRNA序列的表达载体及序列本身，扩增所需引物，转基因细胞系及宿主菌等均属于本发明的保护范围。ntent="drawing" 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