本发明一种硼酸介导的聚合酶链反应检测DNA中5-羟甲基胞嘧啶的方法和试剂盒。本发明结合葡萄糖基化反应,利用硼酸及其衍生物试剂可与葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶中的邻二醇发生的共价作用,显著增加被复制碱基单元的体积,有效抑制聚合酶扩增反应的特点,提出硼酸介导的DNA聚合酶链扩增反应,可特异性地识别特定基因/片段中的5-羟甲基胞嘧啶。在此基础上,发展了一种快速、灵敏测定5-羟甲基胞嘧啶的试剂盒,可应用于各种细胞分析;与传统的检测试剂盒相比,该方法不受酶切位点限制,可适用于各种序列中5-羟甲基胞嘧啶的分析鉴定。本试剂盒具有广阔的应用前景,对于进一步阐明5-羟甲基胞嘧啶的生物学功能具有十分重要的意义。