本发明涉及生物制药技术领域，公开了一种T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法；本发明将一个IL-2启动子驱动的报告基因载体转染Jurkat细胞，经加压筛选和单克隆分离培养得到稳定单克隆细胞株Jurkat IL-2P Luc。加入CD3抗体和表达共刺激分子CD80/86的Raji细胞，同时激活T细胞活化所需的第一通路和第二通路，使T细胞活化，同时加入待测调节剂，检测IL-2启动子驱动的报告基因萤光素酶的表达。通过所加调节剂用量与萤光素酶表达量的剂量依赖关系对T细胞活化调节剂的生物学活性进行定量检测。本发明操作简单，灵敏度高，可重复性好，对于T细胞活化调节剂质量控制和临床应用具有重要意义。
1.一种T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法；包括：步骤一：IL-2启动子驱动的报告基因载体的构建；步骤二：带有IL-2启动子驱动的报告基因的稳定细胞株的构建；步骤三：对T细胞活化调节剂的生物学活性进行检测，其检测方法包括：在CD3抗体和表达CD80/86的B细胞系Raji共同作用下，上述稳定细胞株被激活，IL-2启动子驱动的萤光素酶报告基因表达上调，同步加入T细胞活化调节剂，通过检测报告基因表达量，定量评估T细胞活化调节剂生物学活性。
2.根据权利要求1所述的T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法，所述步骤一中，所述IL-2启动子驱动的报告基因载体的构建方法包括：将IL-2启动子构建至萤光素酶报告基因上游，用以驱动IL-2表达。
3.根据权利要求1所述的T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法，所述步骤二中，带有IL-2启动子驱动的报告基因的所述稳定细胞株的构建方法包括：所述细胞株为T细胞，T细胞被激活后，IL-2表达上调，同时，T细胞株转染了IL-2启动子驱动的萤光素酶报告基因，通过加压筛选和单克隆分离培养，用于T细胞活化调节剂的生物学活性检测。技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体地说是涉及一种T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法。
背景技术
胸腺依赖性淋巴细胞(Thymus-dependentxa0lymphocyte，简称T细胞)功能的抑制或激活在肿瘤免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应中起着极为重要的作用，T细胞活化，不仅需要T细胞受体的第一信号，而且需要第二信号。第一信号来自于T细胞上的CD3/TCR(Txa0cellxa0receptor，T细胞受体)复合物与抗原提呈细胞或其它种类细胞上的主要组织相容性复合体(majorxa0histocompatibilityxa0complex，MHC)及抗原复合物；第二信号即共刺激信号来源于T细胞上的CD28与抗原提呈细胞上的CD80/86的结合，对该信号通路进行调节，如通过CTLA-4竞争性抑制CD28与CD80/86的结合，进而阻断第二信号通路，或者通过CD3抗体竞争性结合CD3/TCR复合物，从而阻断第一信号通路，可起到调节(抑制或激活)T细胞活性的效果。基于此，涌现出大量已上市或在研的针对T细胞活化过程中所涉及的分子事件而设计的药物，以下统称为T细胞活化调节剂。对T细胞活化程度进行检测，是基于细胞水平的在开发此类药物时对其药效进行评估的重要指标。现有的在细胞水平对T细胞活化程度进行检测的方法分为以下几类：第一，检测T细胞活化引起的T细胞增殖效应(如专利CNxa0101427135xa0A)，该方法需要使用原代T细胞，材料来源相对困难且重复性没有保障，同时实验持续时间较长，通常为5-7天；第二，直接检测T细胞活化过程中相关分子，例如mRNA或蛋白的表达(如专利CNxa0101427135xa0A、USxa06114129xa0A、USxa05180662xa0A、CNxa0102811739xa0A和EPxa02510948xa0A1，以及参考文献：Stohlxa0Wxa0etxa0al.,Jxa0Immunol.1990Augxa015；145(4):1078-87.)，该方法实验流程复杂，重复性相对欠缺；第三，检测T细胞对ICAM1等粘附分子的粘附性(如专利CNxa0102811739xa0A和EPxa02510948xa0A1)，该体系同样需要分离原代细胞并存在实验流程复杂，重复性相对欠缺等问题；第四，检测T细胞活化过程中相关分子的启动子驱动的报告基因的表达(如专利USxa05474897xa0A；以及参考文献：Schwarzxa0EMxa0etxa0al.,Procxa0Natlxa0Acadxa0Scixa0Uxa0Sxa0A.1993Augxa015；90(16):7734-8.；Qiuxa0Dxa0etxa0al.,Jxa0Biolxa0Chem.1999Mayxa07；274(19):13443-50.；Yangxa0XYxa0etxa0al.,Jxa0Biolxa0Chem.2000Feb18；275(7):4541-4.；Weaverxa0JRxa0etxa0al.,Molxa0Immunol.2007Apr；44(11):2813-9.)，此类方法相对上述三种方法而言，具有快速、简便、重复性较好的特点。基于报告基因系统的在细胞水平对T细胞活化程度进行检测的方法，国内目前尚无相关专利报道。国外已有报道的第四类检测手段中，USxa05474897xa0A所提供的实验体系中采用了IL-2启动子中的CD28RE驱动报告基因的表达，CD28RE位于IL-2转录起始位点上游-164到-154位(参考文献：Butscherxa0WGxa0etxa0al.,Jxa0Biolxa0Chem.1998Janxa02；273(1):552-60.)，而IL-2启动子包括-300位到+40位，含有除CD28之外的多个反应元件，IL-2的转录表达受到这些反应元件的共同调控，仅用CD28E不能很好的模拟并反映在外界刺激作用下T细胞活化后內源IL-2的转录表达情况；第四类检测手段中另一类技术手段(如参考文献：Schwarzxa0EMxa0etxa0al.,Procxa0Natlxa0Acadxa0Scixa0Uxa0Sxa0A.1993Augxa015；90(16):7734-8.；Qiuxa0Dxa0etxa0al.,Jxa0Biolxa0Chem.1999Mayxa07；274(19):13443-50.；Yangxa0XYxa0etxa0al.,Jxa0Biolxa0Chem.2000Febxa018；275(7):4541-4.；Weaverxa0JRxa0etxa0al.,Molxa0Immunol.2007Apr；44(11):2813-9.)，使用的为phorbol-12-myristatexa013-acetate(PMA)+ionomycin类的组合刺激方式，PMA可以自由进入细胞膜，直接作用于细胞内的PKC(蛋白激酶C)；inonomycin为钙离子载体，使细胞外Ca2+内流，PKC和Ca2+产生的信号共同作用于核内的转录因子，启动T细胞活化相关基因(如IL-2)的转录和蛋白合成；该刺激方式作用快，但由于直接作用于T细胞活化信号通路的中下游，无法模拟肿瘤免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应等病理条件下T细胞的活化方式。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供了一种T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法，T细胞活化调节剂可促进或抑制T细胞激活，若此类调节剂具备生物学活性，可通过检测此类调节剂来检测到T细胞活化程度的变化；本发明根据T细胞活化需要第一信号和第二信号的同时激活，且该过程中的关键事件为IL-2表达上调的机理，利用在第一信号和第二信号同时激活时可大量表达IL-2的T细胞Jurkat，全基因合成IL-2启动子-329到+48位，将其连接至报告基因萤光素酶(Luciferase)上游，构建IL-2启动子驱动的报告基因萤光素酶表达载体，将该表达载体电转染Jurkat细胞，通过转染效率检测、加压筛选，获得带有IL-2启动子驱动的萤光素酶表达框架的稳定细胞株(以下简称为Jurkatxa0IL-2Pxa0Luc细胞株)，在此基础上，使用CD3抗体和表达CD80/86的Raji细胞作为上游刺激，对该细胞株的效应功能进行检测，并对该检测体系进行优化，对其特异性和重复性进行了评估。本发明具有检测快速、操作简便、重复性好和灵敏度高的特点。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：本发明提供了一种T细胞活化调节剂生物学活性的报告基因检测方法；包括：步骤一：IL-2启动子驱动的报告基因载体的构建；步骤二：带有IL-2启动子驱动的报告基因的稳定细胞株的构建；步骤三：对T细胞活化调节剂的生物学活性进行检测；其检测方法包括：在CD3抗体和表达CD80/86的B细胞系Raji共同作用下，上述稳定细胞株被激活，IL-2启动子驱动的萤光素酶报告基因表达上调，同步加入T细胞活化调节剂，通过检测报告基因表达量，定量评估T细胞活化调节剂生物学活性。优选地，所述步骤一中，所述IL-2启动子驱动的报告基因载体的构建方法包括：将IL-2启动子，从-329到+48位，构建至萤光素酶报告基因上游，用以驱动IL-2表达。更加优选地，所述步骤二中，带有IL-2启动子驱动的报告基因的所述稳定细胞株的构建方法包括：所述细胞株为T细胞，T细胞被激活后，IL-2表达上调，同时，T细胞株转染了IL-2启动子驱动的萤光素酶报告基因，通过加压筛选和单克隆分离培养，用于T细胞活化调节剂的生物学活性检测；其中，所述Jurkat为人急性T淋巴细胞白血病细胞；所述Raji为人B淋巴细胞瘤细胞；所述PBMC，peripheralxa0bloodxa0mononuclearxa0cell为外周血单个核细胞；所述CD为clusterxa0ofxa0differentiation，决定簇分子；所述PHA，phytohaemagglutinin为植物血凝素；所述PMA，phorbol-12-myristatexa013-acetate为佛波酯；所述Ionomycin为离子霉素；所述IL-2,interleukinxa02为白细胞介素2；所述CD28RE，CD28responsexa0element为CD28反应元件；所述CTLA4，cytotoxicxa0Txa0lymphocyte-associatedxa0antigen-4为细胞毒T淋巴细胞相关抗原4；所述Fc,crystallinexa0fragment为结晶片段。本发明与现有技术相比具有以下优点：国内尚无用报告基因检测法对T细胞活化调节剂生物学活性进行定量评估的实验体系相关报道，本发明填补了这一空白；与使用原代T细胞进行检测的实验体系相比，本发明所提供的检测方法，无需使用人外周血，解决了目前人外周血来源困难且不同人来源的外周血所对应的实验结果一致性较差这一难题；同时无需分离原代T细胞，避免了繁琐的PBMC分离及T细胞磁珠分选等流程，缩短实验流程，简化实验操作步骤；所使用的上游刺激为CD3抗体和表达CD80/86的Raji细胞，与传统的PHA或PMA+ionomycin的刺激模式相比，本发明所采用的这种刺激方式，更接近肿瘤免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应等病理情况下体内T细胞激活时的真实情况；同时我们选用了T细胞活化过程中的关键事件IL-2表达为检验点，选取IL-2启动子-329到+48位，用以驱动报告基因萤光素酶的表达，相较于已有报道的实验体系中所采用的CD28RE(位于IL-2转录起始位点上游-164到-154位)，其所含有的IL-2转录因子作用位点更为全面，能更加全面真实的反映IL-2在转录水平激活的状态，定量评估T细胞活化程度，进而对T细胞活化调节剂生物学活性进行定量检测；该体系具有快速、操作简便、重复性好的特点，对T细胞活化调节剂质量控制和临床应用具有重要意义。说明书附图图1示例性地示出了未转染质粒的Jurkat细胞通过流式细胞术检测的GFP表达情况示意图；图2示例性地示出了转染GFP的Jurkat细胞通过流式细胞术检测的GFP表达情况示意图；图3示例性地示出了检测CD3抗体和Raji共刺激后，不同克隆萤光素酶表达情况示意图；图4示例性地示出了CTLA4-Fc融合蛋白抑制IL-2表达剂量依赖曲线示意图；图5示例性地示出了初步方法学验证-特异性示意图；图6示例性地示出了初步方法学验证-重复性示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例详述本发明。1.pGL4.15-IL-2P质粒的构建1.1全基因合成IL-2启动子(-329到+48位)，其中上游带有KpnI酶切位点GGTACC，下游带HindIII酶切位点AAGCTT，全序列如下：GGTACCGAAAATTTTCTGAGTTACTTTTGTATCCCCACCCCCTTAAAGAAAGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTTAATTGCATGAATTAGAGCTATCACCTAAGTGTGGGCTAATGTAACAAAGAGGGATTTCACCTACATCCATTCAGTCAGTCTTTGGGGGTTTAAAGAATTCCAAAGAGTCATCAGAAGAGGAAAAATGAAGGTAATGTTTTTTCAGACAGGTAAAGTCTTTGAAAATATGTGTAATATGTAAAACATTTTGACACCCCCATAATATTTTTCCAGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTTCAAGAGTTCCCTATCACTCTCTTTAATCACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCACAAAGCTT1.2全基因合成产物与pGL4.15质粒(购自Promega,货号E6701)经KpnI和HindIII酶切后，将IL-2启动子连入pGL4.15，构建pGL4.15-IL-2P质粒，送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，完全正确。2稳定细胞株的筛选2.1转染(1)提前2天，复苏Jurkat细胞(购自ATCC，货号TIB-152)；(2)取生长培养基(RPMI1640(购自GIBCO，货号61870-036500ML)+10％牛血清(购自ExCell，货号FDN500)+1％双抗(购自Life，货号15070-063))加入6孔板的2孔中，3ml/孔，在培养箱中预热；另取220ulxa0Cellxa0linexa0Nucleofectorxa0Solutionxa0V(购自Lonza，货号VCA-1003))在培养箱中预热10min；(3)分别取5ugxa0pGL4.15-IL-2P质粒，5ugxa0pmaxGFP质粒(转染对照)于2支无菌1.5ml离心管中备用；(4)Nucleofector电转仪(Lonza)开机，选择程序X-001；(5)Jurkat细胞计数，分别取300万个细胞于2支无菌1.5ml离心管中，90g离心5min，弃尽上清；(6)每管加入100ul预热的Cellxa0linexa0Nucleofectorxa0Solutionxa0V，轻吹加入含有质粒的无菌1.5ml离心管中，再轻吹加入电转杯中；(7)将电转杯放入电转仪，按‘X’键，完成电转后，用试剂盒提供的吸管取预热的生长培养基加入电转杯底部略吹吸后吸出细胞，加至6孔板培养基中，培养24h。2.2检测转染效率取转染pmaxGFP质粒的细胞10万个，流式细胞术检测转染效率。转染后位于1通道的细胞的荧光强度明显增强，转染率高达88.5％，转染有效(图1)。2.3加压筛选及Jurkatxa0IL-2Pxa0Luc单克隆细胞株分离培养(1)转染后24h，加入选择培养基(生长培养基+250ug/ml潮霉素)，筛选3周，每3-4天更换一次选择培养基；(2)待对照组细胞全死，筛选完成。计数，选择培养基将细胞稀释至30个细胞/15ml，150ul/孔铺至U底96孔板；(3)每3-4天更换一次选择培养基，培养2周，显微镜下观察，挑选有有单克隆生长的细胞孔，并转移至24孔板，1周后再传至6孔板扩大培养。3.效应功能检测3.1T细胞活化检测体系的建立(1)计数Jurkatxa0IL-2Pxa0Luc细胞，选择培养基将细胞稀释至200万个细胞/ml；(2)计数Raji细胞，选择培养基将细胞稀释至200万个细胞/ml；(3)将上述两种稀释好的细胞等体积混匀，按照100ul/孔的密度铺至V底96孔板；(4)用选择培养基将CD3抗体(购自BDxa0Pharmingen，货号：555337)稀释至终浓度为0.4ug/ml，按照100ul/孔的体积加至上述V底96孔板中，吹吸使其与细胞混匀；(5)细胞于二氧化碳培养箱中培养6h；(6)3000rpm离心5min，吸去细胞上清，50ul/孔加入裂解液Glo-lysis(购自Promega，货号：E2661)，室温裂解5min；(6)吸取10ul细胞裂解物转入白色384孔板(购自PerkinElmer，型号：ProxiPlate-384Plus)，加入萤光素酶底物Bright-Gloxa0Luciferasexa0Assayxa0System(购自Promega，货号E2610)，10ul/孔，反应5min，检测萤光素酶活性。CD3抗体和Raji共刺激细胞后使细胞被激活而表达IL-2，与无刺激的对照组比较IL-2表达量明显增高，说明CD3抗体和Raji共刺激可以激活该转染细胞使其表达IL-2，同步刺激报告基因萤光素酶的表达(图2)。3.2T细胞活化调节剂(以CTLA4-Fc融合蛋白为例)生物学活性检测体系的建立筛选得到的IL-2Pxa0Luc阳性细胞株，根据3.1实验结果，选取1号克隆进行后续实验。检测对CTLA4-Fc融合蛋白的反应性，细胞密度为10万个/孔，CTLA4-Fc起始浓度为67ug/ml，10倍比系列稀释13个梯度，共14个浓度点。CTLA4-Fc作用6小时检测萤光素酶活性。加入梯度稀释的CTLA4-Fc融合蛋白后，随着CTLA4-Fc浓度增大，萤光强度逐渐减小，即IL-2表达量逐渐减少，可见细胞的活化率降低，说明该体系可用于定量检测T细胞活化调节剂的生物学活性(图3)。4初步方法学验证选用无关IgG作为阴性对照，评估该方法的特异性；对同一批次的CTLA4-Fc融合蛋白进行同次多样品检测,评估该方法的重复性。结果显示，加入无关IgG，未观察到T细胞活化的抑制，加入CTLA4-Fc融合蛋白后，T细胞活化被显著抑制(图4)。重复性结果显示，CV％(变异系数)为9.32％，具有较好的重复性(表1，图5)。表1、初步方法学验证-重复性样品名
IC₅₀(mol/L)
CTLA4-Fcxa01
2.54E-09
CTLA4-Fcxa02
2.01E-09
CTLA4-Fcxa03
2.45E-09
CTLA4-Fcxa04
2.18E-09
CTLA4-Fcxa05
2.42E-09
平均值
2.1816E-09
标准偏差
2.62761E-10
CV％
9.32％
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。